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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12339 (2023) Citar este artículo

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El transporte de líquido intersticial y solutos desempeña un papel fundamental en la eliminación de los desechos metabólicos del cerebro. Se ha demostrado que la aplicación transcraneal de ultrasonido focalizado (FUS) promueve la captación localizada de solutos del líquido cefalorraquídeo en el parénquima cerebral; sin embargo, se desconocen sus efectos sobre el transporte y la eliminación de solutos intersticiales. Demostramos que la aplicación pulsada de FUS de baja intensidad al cerebro de rata mejora el transporte de trazadores fluorescentes inyectados intracorticalmente (ovoalbúmina y dextrano de alto peso molecular), produciendo una mayor distribución del volumen del trazador parenquimatoso en comparación con el grupo de control no sonicado (ovoalbúmina en un 40,1% y dextrano en un 34,6%). Además, FUS promovió el drenaje de ovoalbúmina intersticial inyectada a los ganglios linfáticos cervicales (cLN) tanto superficiales como profundos ipsilaterales a la sonicación, observándose un 78,3 % más de drenaje en los cLN superficiales en comparación con el hemisferio no sonicado. La aplicación de FUS aumentó el nivel de transporte de solutos visible desde la superficie dorsal del cerebro, con un área aproximadamente un 43 % mayor y una intensidad de fluorescencia aproximadamente un 19 % mayor que el grupo no sonicado, especialmente en la superficie pial ipsilateral a la sonicación. La sonicación no provocó excitación neuronal a nivel de tejido, medida mediante un electroencefalograma, ni alteró el peso molecular de los trazadores. Estos hallazgos sugieren que la FUS transcraneal no térmica puede mejorar el transporte advectivo de solutos intersticiales y su posterior eliminación de una manera completamente no invasiva, ofreciendo su potencial utilidad no farmacológica para facilitar la eliminación de desechos del cerebro.

El sistema linfático desempeña un papel importante en el transporte/eliminación de subproductos metabólicos y desechos del cuerpo, que son recolectados por redes de vasos linfáticos ampliamente distribuidos por todos los órganos. Sin embargo, el sistema nervioso central (SNC) carece de vasos linfáticos específicos dentro del parénquima neuronal, mientras que la tasa metabólica relativamente alta de las células neuronales y su alta susceptibilidad a los cambios en el entorno extracelular requieren una eliminación eficiente de los desechos para su funcionamiento normal. Los estudios han informado asociaciones entre la eliminación aberrante de desechos cerebrales con la demencia y la enfermedad de Alzheimer (EA)1,2, así como con el envejecimiento3,4. Sobre esta base, los mecanismos de la función linfática del SNC han despertado un importante interés en la investigación.

El cerebro y la médula espinal están inmersos en líquido cefalorraquídeo (LCR), que es producido principalmente por el plexo coroideo que recubre los ventrículos cerebrales5. El espacio entre las células neuronales, incluida la matriz extracelular (es decir, el espacio intersticial), contiene líquido intersticial (ISF), que tiene una composición similar al LCR6. El intercambio mutuo de líquido/soluto entre el FIS y el LCR, ambos separados del torrente sanguíneo por la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la barrera hematoencefálica (B-CSF), es importante para la eliminación de desechos y subproductos metabólicos del cerebro. , estando mediado por varios mecanismos que incluyen la difusión, el transporte por canales iónicos y el transporte impulsado por presión hidrostática/osmótica7,8,9. En cuanto a los mecanismos que mueven los solutos intersticiales a través del neuropilo denso, se han identificado como los principales factores contribuyentes. También se encontró que factores fisiológicos como el sueño y la actividad física modulan el grado de transporte; por ejemplo, se ha demostrado que el sueño en la etapa de ondas lentas aumenta el espacio intersticial13, mientras que el funcionamiento voluntario de una rueda eleva el transporte linfático en ratones14.

Además de las contribuciones del transporte de agua mediado por AQP4 y la difusión pasiva de solutos, el flujo convectivo masivo de LCR a lo largo del espacio perivascular (PVS) es otro elemento de transporte importante para expulsar los solutos del cerebro. El PVS recubre la vasculatura cerebral en una red intrincada y sirve como un pasaje importante para el transporte del LCR, mediante el cual los gradientes de presión generados por la pulsación arterial (también conocido como "bombeo perivascular"15,16) generan un flujo convectivo de LCR y un movimiento advectivo de soluto que lo acompaña. que también facilita el movimiento de solutos intersticiales/LCR de forma independiente de AQP411,17,18. Recientemente, un estudio de imágenes in vivo de dos fotones reveló evidencia visual sorprendente del movimiento advectivo de partículas exógenas a través del PVS adyacente a las arterias piales en ratones19. Aunque las rutas exactas todavía están bajo intensa investigación, hasta ahora se entiende que los solutos/desechos salen del cerebro a través de varias vías, como la granulación aracnoidea (que sale a los senos venosos meníngeos), la mucosa nasal o los vasos linfáticos meníngeos (que salen a los senos venosos meníngeos). ganglios linfáticos)6,9.

La modulación controlada del transporte homeostático de solutos cerebrales mediante la regulación de las actividades de AQP4 o la promoción de la difusión pasiva de los solutos del LCR sería extremadamente desafiante con la tecnología disponible actualmente. Sin embargo, es posible generar un flujo masivo convectivo impulsado por la presión en el cerebro, lo que nos llevó a buscar una técnica no invasiva que mejore el transporte y la eliminación de solutos intersticiales del cerebro. La aplicación de ondas de ultrasonido impone fuerzas de radiación no térmicas sobre el medio objetivo que inducen un flujo direccional. Este fenómeno, conocido como efecto de transmisión acústica, se ha aplicado para administrar infusiones al cerebro mediante la integración de una fuente generadora de ultrasonido en la aguja/cánula de inyección en el contexto de la administración mejorada por convección20,21. Raghavan propuso teóricamente el uso de transmisión acústica para promover el movimiento advectivo de varios solutos cerebrales de forma no invasiva22.

Las técnicas de ultrasonido enfocado (FUS) pueden entregar ondas de presión acústica convergentes a tejidos biológicos de interés, utilizando la geometría del transductor de ultrasonido, una lente acústica o mediante la actuación de un transductor de elementos múltiples23. El uso de un rango de frecuencia de ultrasonido bajo (del orden de 200 a 700 kHz, que es más bajo que los utilizados en imágenes de ultrasonido) permite la transmisión de ultrasonido a través del cráneo intacto de una manera completamente no invasiva24. Con su exquisita selectividad espacial y penetración profunda en el cerebro, la FUS transcraneal (tFUS) se ha utilizado en una amplia gama de aplicaciones, como la ablación de tejido cerebral mediante ultrasonido de alta intensidad25, la modulación de la función cerebral regional mediante ultrasonidos no térmicos de baja intensidad26 y la administración de fármacos de alto peso molecular (MW) al cerebro al alterar la BHE cuando se combinan con agentes de contraste de microburbujas27.

Investigaciones recientes han revelado que la aplicación pulsada de FUS de baja intensidad a través del cráneo de rata puede mejorar el transporte de trazadores del LCR (ovoalbúmina inyectada intracisternalmente, OA) y administrar moléculas farmacológicas de alto PM (panitumumab; 150 kDa MW) al tejido cerebral de una región específica. sin alterar la BBB28,29. Estos estudios ofrecieron un potencial prometedor de tFUS para mejorar el transporte de solutos del LCR; sin embargo, quedan preguntas abiertas con respecto a si puede mejorar el transporte y la eliminación de los solutos inyectados intracorticalmente del cerebro. Para abordar estas preguntas, inyectamos trazadores de solutos fluorescentes con diferente PM (OA de 45 kDa e isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano de 2000 kDa, FITC-d) en la corteza cerebral de rata y aplicamos FUS no térmico de baja intensidad en el sitio de inyección. Posteriormente se examinó el alcance de la distribución del trazador afectada por la sonicación. Además, para examinar si el FUS puede mejorar la eliminación de solutos intersticiales del cerebro, realizamos un experimento separado para cuantificar el grado de drenaje de OA a los ganglios linfáticos cervicales (cLN) promovido por el FUS.

El procedimiento experimental se ilustra en la Fig. 1a. Después de exponer la duramadre a través de un orificio perforado a través del cráneo, se inyectaron intracorticalmente 0,5 µl de Texas Red OA de 45 kDa y FITC-d de 2000 kDa, constituidos por separado a una concentración de 0,5 % en peso en LCR artificial (aCSF) (3 mm a la derecha y 1 mm a la derecha). mm caudal al bregma, 2 mm de profundidad) a ratas macho Sprague-Dawley (n = 28) bajo anestesia con ketamina y xilazina. Para evitar los efectos de la agregación de OA en una solución de FITC-d, los trazadores se inyectaron en grupos separados de animales (n = 14 cada uno).

Transporte de trazadores de fluorescencia intracorticales. (a) La ilustración esquemática de los procedimientos experimentales con animales (tiempo de inicio = 0 min con respecto a la inserción de la aguja). El cono azul ilustra el perfil del haz acústico del transductor FUS. (b) Ilustración del esquema de pulsaciones de ultrasonido. (c) El perfil de presión acústica a lo largo del eje longitudinal hasta la sonicación (izquierda) y el plano transversal en el foco (derecha). La flecha indica la dirección de la sonicación. Un perfil focal acústico limitado a todo el ancho a la mitad de la presión máxima (FW90%M) se muestra mediante la línea de puntos blanca y el perfil de ancho completo a la mitad de la presión máxima (FWHM) se muestra mediante la línea punteada blanca. línea de puntos negra (barra = 10 mm). ( d ) Distribuciones ejemplares de OA y FITC-d de una rata. 0 mm en el eje x indica el lugar de la inyección, mientras que la dirección positiva del eje indica la dirección rostral. ( e ) Distribuciones de volumen específicas de corte de OA y ( f ) trazador FITC-d. Las áreas sombreadas representan los cortes que muestran una diferencia significativa (P <0,05) entre las condiciones FUS + y FUS- (n = 7 cada una). Barra de error: error estándar de la media (SEM).

Luego se administró FUS, que operaba a 200 kHz, estereotácticamente en el lugar de la inyección 30 minutos después de la retirada de la aguja de forma pulsada (duración del pulso (PD) de 100 ms y frecuencia de repetición del pulso (PRF) de 1 Hz) durante 30 minutos en un pico espacial. intensidad promedio de pulso (ISPPA) de 5 W/cm2 (ciclo de trabajo del 10%, intensidad promedio temporal máxima espacial de 500 mW/cm2—ISPTA) (el esquema de pulsos se ilustró en la Fig. 1b). El conjunto de parámetros de pulsación, incluida la intensidad acústica, se eligió en función de los parámetros que se ha demostrado que mejoran el transporte de soluto del LCR en ratas sin inducir daño tisular ni alterar la BHE28. El uso de una frecuencia de 200 kHz es aplicable para la administración transcraneal de ultrasonido en humanos debido a una menor pérdida de energía acústica por inserción en el cráneo en comparación con el uso de frecuencias más altas30. La presión en el foco, medida en agua desgasificada, fue de 770 kPa (amplitud pico a pico) con un índice mecánico (IM) correspondiente de 0,86, que era muy inferior al valor límite reglamentario de 1,9 que se define actualmente para el diagnóstico. ecografía de órganos en ausencia de cuerpos gaseosos en adultos31. Un foco acústico, de 5 mm de diámetro y 15 mm de longitud, estaba definido por el perfil unido en todo su ancho a una presión máxima del 90%. En ancho completo a la mitad del máximo (FWHM), el tamaño focal acústico fue de 7 mm de diámetro y 27 mm de longitud (Fig. 1c). La presión máxima dentro del foco se formó a 11 mm de distancia del plano de salida del transductor, y el centro del foco se colocó en las coordenadas de la inyección utilizando una platina robótica de 3 ejes.

Los pesos de los animales fueron indiferentes entre los grupos (prueba H de Kruskal-Wallis; χ2 (3) = 1,06, P = 0,79). Como se sabe que la frecuencia cardíaca y la profundidad anestésica afectan el transporte del LCR19,32, la frecuencia cardíaca/respiratoria, así como los niveles de saturación periférica de oxígeno (SpO2), se midieron cada 15 minutos al inicio de las condiciones experimentales. Estas variables no cambiaron con el tiempo y no fueron diferentes entre las condiciones (todas P > 0,06, Tabla complementaria S1).

Las imágenes de fluorescencia de secciones cerebrales de 200 µm de espesor que abarcan el sitio de la inyección mostraron que la OA y el FITC-d inyectados intracorticalmente fueron transportados a una distancia mayor desde el sitio de la inyección mediante FUS (indicado como 'FUS +') en comparación con el grupo de control sin ultrasonidos ( 'FUS-') (las áreas mostradas por las puntas de flecha, en la Fig. 1d). Según el análisis del volumen de distribución de OA, las condiciones FUS produjeron una dispersión de OA un 40,1% mayor en comparación con la condición de control sin sonicación (FUS +: FUS− = 32,5 ± 6,8: 23,2 ± 4,1 µL, media ± desviación estándar, de una cola, Mann –Prueba de Whitney, puntuación Z (Zs) = 2,36, U = 43,5, P = 0,009). De manera similar, se observó una distribución de FITC-d un 34,6% mayor en la condición FUS (FUS +: FUS− = 3,5 ± 0,4: 2,6 ± 0,6 µL, prueba de Mann-Whitney de una cola, Zs = 2,56, U = 45, P = 0,005). Dentro de cada condición (FUS + o FUS-), el volumen de distribución de OA fue mayor que FITC-d, lo que indica la presencia de transporte dependiente del tamaño que favorece el transporte de OA de pequeño MW (prueba de Mann-Whitney de una cola, Zs = 3,4, U = 49, P = 0,0002 dentro de la FUS +, y Zs = 3,07, U = 49, P = 0,001 dentro de la FUS-).

Las imágenes de fluorescencia de secciones de cerebro contiguas de los animales se alinearon con respecto al sitio de inyección y el volumen del trazador se estimó utilizando criterios automatizados (descritos en "Adquisición y análisis de imágenes fluorescentes" en la sección "Materiales y métodos"). Las comparaciones segmento por segmento entre el volumen de absorción de OA y FITC-d (en µL, mostrado en la Fig. 1e, f, respectivamente) también reflejaron un mayor volumen de ambos trazadores mediante la aplicación de FUS, por lo que la diferencia fue más profunda hacia el lado rostral del sitio de inyección (las áreas sombreadas indican los cortes que muestran un mayor volumen de trazador en FUS + en P <0,05, prueba de Mann-Whitney de una cola). Sin embargo, no encontramos ningún sesgo direccional ventral notable desde el lugar de la inyección (a lo largo de la dirección de propagación acústica), donde el transporte del trazador se produjo radialmente hasta el lugar de la inyección. En la condición de control (FUS-), ambos trazadores exhibieron distribuciones más simétricas alrededor del sitio de inyección.

Debido a que el transporte intersticial de FITC-d de alto MW fue limitado incluso con la aplicación de FUS (según los resultados del primer segmento del estudio), solo se utilizó OA en el estudio posterior que evaluó la eliminación del trazador intersticial a los cLN. Para aumentar la sensibilidad de detección de fluorescencia en los cLN, se inyectaron 2 µl de OA de mayor concentración (1% en peso en aCSF en el mismo lugar en ratas SD (n = 16). El lado hemisférico de la inyección fue aleatorio y equilibrado. Tras un tiempo de espera de 30 minutos después de la retracción de la aguja, se administró FUS en el lugar de la inyección durante 1 h para permitir la eliminación de OA del cerebro a los cLN (FUS +, n = 8, ilustrado en la Fig. 2A, con rutas de drenaje de solutos). a los clN). El resto de los animales (n = 8) no recibieron sonicación, constituyendo la condición de control (FUS-). Los pesos de los animales fueron indiferentes entre los grupos (dos colas, prueba de Mann-Whitney, Zs = 0,47, U = 27, P = 0,64). La frecuencia cardíaca/respiratoria, así como los niveles de saturación periférica de oxígeno (SpO2), se mantuvieron sin cambios con el tiempo y no variaron entre las condiciones FUS (todas P > 0,25, Tabla complementaria S2).

Transporte de trazador de ovoalbúmina inyectado intracorticalmente. (A) Ilustración del drenaje de soluto al clN profundo (dcLN) y superficial (scLN) mediante la aplicación de FUS. Las líneas de puntos indican las posibles rutas de drenaje. (B) Ejemplos de imágenes de fluorescencia de la superficie dorsal entre las condiciones FUS + y FUS- y (C) imagen de fluorescencia correspondiente ipsilateral al sitio de inyección, OB: bulbo olfatorio, Crbl: cerebelo, MCA: arteria de la superficie pial cerebral media (indicada por puntas de flecha ), CRV: vena de la superficie pial rininal caudal (indicada por flechas), barra = 5 mm. Las áreas del cuadrado amarillo fueron ampliadas en la imagen en escala de grises de la derecha. (D) Distribuciones ejemplares de OA de los cortes cerebrales entre las condiciones FUS + y FUS-, barra = 5 mm. (E) Distribuciones de volumen de OA específicas de cada sector. 0 mm en el eje x indica el lugar de la inyección, mientras que + indica la dirección rostral. Las áreas sombreadas en rosa representan las rebanadas que muestran una diferencia significativa (P <0,05) entre las condiciones (n = 8 cada una). (F) Comparaciones sobre el área de distribución de OA (en mm2) y la fluorescencia (en unidades arbitrarias, au) entre las condiciones FUS + y FUS-. Los círculos indican los valores individuales de 8 animales.

Encontramos una mayor distribución del volumen de OA a partir de las imágenes de la superficie dorsal del cerebro (un ejemplo se muestra en la Fig. 2B, todas las imágenes se muestran en la Fig. S1 complementaria). Las imágenes de fluorescencia de la superficie lateral de la inyección del trazador también reflejaron una distribución más amplia de OA impactada por la sonicación, con OA lindando con el lado de las vasculaturas de la superficie pial, que incluyen la arteria cerebral media (MCA) y las venas rininales caudales (CRV) (Fig. .2C, indicado con puntas de flecha y flechas, respectivamente, n = 5 como se muestra en la figura complementaria S2).

A partir del examen de imágenes seccionales del cerebro, un volumen mayor (es decir, 2 µL) y un tiempo de sonicación/monitoreo más largo (60 min) produjeron una captación más amplia de OA en el parénquima cerebral, abarcando ± 3 mm del lado rostral/caudal de la inyección (Fig. .2D). La aplicación de FUS dio como resultado un mayor grado de distribución de volumen de OA en comparación con los controles no sonicados, siendo el volumen de distribución de OA ~ 125 % mayor que el control (FUS +: FUS- = 173,9 ± 59,8: 77,2 ± 64,57 µL, Mann Whitney prueba, una cola, Zs = 1,93, U = 40, P = 0,026). Las comparaciones rebanada por rebanada del volumen del trazador (en µL) mostraron que la sonicación mejoró el transporte intersticial de la OA con un sesgo espacial hacia la dirección rostral del sitio de inyección (Fig. 2E, área sombreada, en P <0,05, una cola Prueba de Mann-Whitney). Este mayor volumen de captación del trazador fue respaldado por imágenes de la superficie dorsal del cerebro que muestran un área ~ 43% mayor (FUS +: FUS− = 8,6 ± 1,4: 6,0 ± 2,4 mm2, prueba de Mann-Whitney de una cola, Zs = 2,36, U = 55, P = 0,009), así como ~ 19 % más de intensidad de fluorescencia (FUS +: FUS− = 174,2 ± 14,3: 146,6 ± 24,4 au, una cola, prueba de Mann-Whitney, Zs = 2,43, U = 55, P = 0,007, figura 2F).

El número (entre 3 y 6) y las áreas (33,1–77,5 mm2) de los ganglios linfáticos fueron indiferentes entre las condiciones FUS + y FUS-, así como entre los lados de la inyección (prueba de Mann-Whitney de dos colas, todas P > 0,05 , información detallada en la Tabla complementaria S3 y la Fig. S3). La aplicación de FUS dio como resultado una mayor captación de OA en los cLN (imagen de ejemplo que se muestra en la Fig. 3a), mientras que el% de captación en el cLN profundo (dcLN) fue menor que en el superficial (scLN) (prueba de Mann-Whitney de una cola). , Zs = 6,23, U = 54, P < 0,001). En la condición FUS +, el área de captación de OA en el dcLN fue significativamente mayor desde el lado ipsilateral a la sonicación (IL, 1,4 ± 1,8%) que el del lado contralateral (CL, 0,5 ± 0,6%; Fig. 3b, uno). -de cola, prueba de rango con signo de Wilcoxon, Zs = 1,76, P = 0,039, n = 8), así como la del lado contralateral a la inyección durante la condición de control (FUS-, 0,4 ± 0,9%, de una cola, Mann-Whitney prueba, Zs = 1,96, U = 53, P = 0,02). Sin embargo, esta diferencia no se observó con respecto a la captación de OA en dcLN ipsilateral a la inyección de los animales de control (0,5 ± 0,9%, prueba de Mann-Whitney de dos colas, Zs = 1,21, U = 44, P = 0,23).

Drenaje del trazador de ovoalbúmina inyectado intracorticalmente a los ganglios linfáticos cervicales. (a) (fila superior) Imágenes de campo brillante de cLN extraídos de condiciones FUS + y FUS- y (fila inferior) imágenes fluorescentes correspondientes superpuestas sobre fluorescencia de OA umbralizada (en rojo). El contorno de dcLN está marcado con una línea de puntos amarilla, mientras que scLN está marcado con una línea de puntos blanca. IL: ipsilateral a FUS/lugar de inyección, CL: contralateral a FUS/lugar de inyección. Barra = 5 mm. (b) El área porcentual de la fluorescencia de OA de los dcLN y (c) de los scLN, medida a partir de las condiciones FUS + y FUS- (cada una de n = 8 animales). La línea negra indica P <0,05 de la prueba de rango con signo de Wilcoxon y las líneas grises indican P <0,05 de la prueba de Mann-Whitney.

En scLN, FUS produjo una captación 78,3% mayor de OA en el lado inyectado (23,7 ± 5,2% de área, Fig. 3c) en comparación con el lado contralateral (13,3 ± 6,6%; prueba de rango con signo de Wilcoxon de una cola, Zs = 2,42 , P = 0,008, n = 8). El grado de captación de OA también fue mayor que el de ambos lados del scLN obtenido en la condición de control (FUS-, IL: CL = 14,0 ± 7,6: 10,8 ± 12,2%, prueba de Mann-Whitney de una cola, Zs = 2,56, U = 56, P = 0,005 y Zs = 1,96, U = 51, P = 0,02, respectivamente). Dentro de la condición de control (FUS-), no hubo diferencias en el área porcentual de captación de OA entre los lados de la inyección de OA (prueba de rango con signo de Wilcoxon de dos colas, Zs = 0,2, P = 0,2, n = 8). Observamos que la captación del trazador tanto en dcLN como en scLN mostró grandes variaciones en el drenaje de OA dentro del grupo, especialmente en dcLN donde no se detectó drenaje aparente de OA en algunos animales.

Como el uso de un parámetro acústico específico también puede estimular el cerebro26,33,34, se midió el EEG en un grupo separado de animales (n = 9, peso = 285,7 ± 10,5 g) para evaluar si la sonicación aplicada daba como resultado una activación neuronal. Se encontró que la sonicación no provocó ningún pico de EEG distinguible de la condición de control (prueba t de dos colas, puntuación t < 1,49; P > 0,16 en todos los puntos temporales) y las amplitudes de la señal permanecieron dentro del nivel de ruido (± 3 µV; Fig. 4a), lo que indica la ausencia de estimulación cerebral inducida por sonicación.

Evaluación de características del EEG de ratas, peso molecular de los trazadores y evaluación de los efectos térmicos de FUS. (a) EEG promedio adquirido de la condición FUS (FUS +; línea roja) y sin sonicación (FUS-; línea azul) que abarca desde 100 ms antes del inicio de la sonicación hasta 700 ms después. El área sombreada indica el error estándar (n = 9) y el cuadro gris indica la duración de la sonicación (100 ms). No hubo diferencia estadística de voltaje en el tiempo entre las dos condiciones. ( b ) Electroforesis en gel de OA y FITC-d. La elución de cada trazador se fotografió en el mismo campo de visión mediante exposición automática y se recortó con espacios en blanco. En la figura complementaria S4 se muestran fotografías de gel de cuerpo entero sin recortar. (c) El mapa de intensidad acústica pseudocoloreado normalizado con respecto al valor máximo obtenido de la simulación numérica se mostró en triplanos de enfoque acústico (obtenido de un cráneo de rata, delineado en un perfil craneal blanco). El perfil del transductor está marcado por la línea roja. Barra = 5 mm. (d) Estimación numérica de la temperatura del tejido en el máximo local de (i) el foco acústico geométrico, (ii) el tejido cerebral que interactúa con la superficie del cráneo frente a la sonicación incidente y (iii) la interfaz de la base del cerebro-cráneo.

También realizamos electroforesis en los dos trazadores fluorescentes para examinar si la sonicación alteraría sus distribuciones de MW, ya que el dextrano es una molécula de cadena larga. El OA de PM más pequeño eluyó más lejos que FITC-d, por lo que la mayor parte de la fluorescencia de FITC-d permaneció dentro del pozo (Fig. 4b; elución en gel completa que se muestra en la Fig. S4 complementaria). Una parte de la fluorescencia de FITC-d se detectó a una distancia mayor (9,5 ± 0,3 mm; n = 16) en comparación con la distancia de elución del OA de 45 kDa (8,9 ± 0,2 mm mostrado como un 'rastro'; de una cola Prueba t, n = 16, P < 0,001), lo que sugirió que FITC-d contenía moléculas de dextrano menores de 2000 kDa. Sin embargo, no hubo diferencias en la distancia de elución entre las condiciones FUS− y FUS + para ambos trazadores (FITC-d, FUS-: FUS + = 9,5 ± 0,3: 9,5 ± 0,3 mm; OA, FUS−: FUS + = 8,9 ± 0,2: 8,8 ± 0,2 mm, n = 8 cada grupo, prueba t de dos colas, todos P > 0,7), lo que indica que la sonicación no alteró su PM.

La simulación numérica se realizó utilizando datos de tomografía computarizada (TC) de cráneo de rata (n = 3) en dos pasos: (1) para estimar la distribución de intensidad acústica in situ modelando la propagación de ondas acústicas en la cavidad craneal de la rata y (2) evaluar la temperatura del tejido cerebral y las interfaces cráneo-cerebro resolviendo la ecuación de transferencia de biocalor. Las distribuciones espaciales simuladas de la intensidad acústica obtenidas del cráneo de un roedor se muestran en las secciones de triplano a lo largo de la ruta de sonicación (Fig. 4c). Además del área focal geométrica encontrada en el lugar de la inyección (ISPPA 4,4 ± 0,2 W/cm2, presión pico a pico de 679,6 ± 23,1 kPa, que se muestra en la Fig. 4c-i), identificamos máximos de intensidad locales adicionales en la superficie del cráneo frente a las ondas FUS incidentes (ISPPA 4,5 ± 0,4 W/cm2, presión pico a pico de 698,1 ± 61,9 kPa, en la Fig. 4c-ii) y en el tejido cerebral que interactúa con la base del cráneo (ISPPA 4,7 ± 0,4 W/cm2, presión pico a pico de 722,2 ± 57,1 kPa, en la figura 4c-iii, los resultados de la simulación se muestran en la figura complementaria S5). La formación de máximos locales adicionales, que produjeron intensidades ligeramente más altas cerca de las interfaces del cráneo, se debió a las reverberaciones acústicas asociadas con el pequeño tamaño del cráneo de la rata en comparación con la longitud de onda del ultrasonido (λ = ~ 7 mm en agua)35. El análisis térmico de estos máximos locales, a pesar del uso de una sobreestimación conservadora de la deposición de calor, mostró solo una ligera elevación de <0,027 °C, alcanzando un máximo en estado estacionario dentro de los 7 minutos (404 s) de la sonicación (Fig. 4d).

Ya se ha demostrado que los parámetros de sonicación utilizados en el presente estudio no causan ningún daño al tejido cerebral mediante un análisis histológico completo28; no obstante, evaluamos los efectos de una sonicación de 1 h de duración aplicada a la misma coordenada de inyección del trazador (pero sin realizar la inyección) en dos ratas SD macho (que pesaban 270 y 275 g). El comportamiento de los animales fue monitoreado durante el período de supervivencia de 1 semana (observación de 20 minutos realizada cada dos días). Ambos animales mostraron un comportamiento normal, y el análisis histológico de las regiones cerebrales sonicadas no reveló ningún signo de daño tisular (datos ejemplares mostrados en la Fig. 5) en términos de integridad/hemorragia tisular global (de hematoxilina y eosina [H&E]), actividad apoptótica (mediante tinción de inmunohistoquímica [IHC] con caspasa-3), daño isquémico (mediante fucsina ácida de vanadio [VAF]-azul de toluidina) e infiltraciones gliales (mediante tinción de proteína ácida fibrilar glial [GFAP]).

Histología ejemplar de los tejidos cerebrales. Fila superior: imágenes microscópicas teñidas con H&E, caspasa-3, VAF-azul de toluidina y GFAP (de la columna de izquierda a derecha) de cortes de cerebro sonicados. barra = 2 mm, fila inferior: imágenes ampliadas del tejido cerebral sonicado (rodeado por los rectángulos de puntos). barra = 0,5 mm L = izquierda; R = correcto.

Ha surgido cada vez más evidencia que respalda el vínculo entre la eliminación aberrante de solutos cerebrales y diversas afecciones neurológicas, como las secuelas de una lesión cerebral traumática36,37, la hidrocefalia idiopática de presión normal38, el accidente cerebrovascular39 y la neurodegeneración40. Los medios no invasivos para mejorar el transporte de solutos desde el parénquima cerebral pueden brindar nuevas oportunidades terapéuticas al mejorar la eliminación de desechos no deseados del cerebro. La sonicación por ultrasonido en combinación con la administración intravenosa de agentes de contraste de microburbujas (MB) abre temporalmente la BHE, lo que permite la administración de macromoléculas a través de la BHE para diversos fines terapéuticos27,41. También se ha demostrado que la técnica promueve el transporte de agua intersticial mediado por la regulación positiva de la expresión de AQP442 o la eliminación de beta amiloide (Aβ) del parénquima cerebral al LCR en modelos animales43. A pesar de su potencial prometedor para mejorar la eliminación de solutos del cerebro, el uso conjunto de MB-FUS conlleva un riesgo de hemorragia local por una alteración excesiva de la BHE inducida por la cavitación inercial44,45. En el presente estudio, demostramos que la aplicación transcraneal de FUS, administrada a un nivel de presión que no causa alteración de la BHE (amplitud pico a pico de 770 kPa)28 sin utilizar MB, no solo promovió el transporte de fluorescentes inyectados intracorticalmente trazadores, sino que también facilitó su eliminación del cerebro.

Al comparar los volúmenes de distribución entre OA y FITC-d en el cerebro de rata, encontramos que el OA de MW más pequeño se transportaba más lejos que el FITC-d de MW más alto, independientemente de la presencia de FUS. Este hallazgo concuerda con la observación anterior de que el transporte de solutos intersticiales depende del tamaño11. Curiosamente, esta dependencia puede sugerir la presencia de un componente difusional en el transporte intersticial de solutos mezclado con el transporte convectivo46,47. Aún no se ha resuelto un debate sobre el modo dominante de transporte de solutos dentro del "verdadero" espacio intersticial (que se distingue de las estructuras neurovasculares, incluido el PVS), entre advección (que acompaña al flujo convectivo) y difusión, y nuestra observación puede indicar la contribución de dos modos de transporte de solutos que funcionan al unísono.

El examen corte por corte de la distribución del trazador en el cerebro reveló que FUS mejoró el transporte tanto de OA como de FITC-d, mostrando una mayor distribución del trazador hacia la dirección rostral desde el lugar de la inyección. Esto indica la presencia de transporte anisotrópico de soluto intersticial/LCR. Sin embargo, los resultados difirieron del sesgo caudal informado en el transporte de solutos, que se ha demostrado por el movimiento de la inmunoglobulina de gadolinio que acompaña a la coinfusión intratecal de manitol hiperosmolar48 o del tinte azul de Evans intraparenquimatoso en roedores49. Postulamos que el bisel de la aguja que mira en dirección rostral durante la inyección podría haber introducido el sesgo espacial en el transporte; sin embargo, también es probable la contribución de las vías de eliminación linfática del cerebro nasal que están rostrales al cerebro50,51. También es digno de mención que la mejora del transporte del trazador se produjo radialmente desde el lugar de la inyección en lugar de a lo largo de la dirección de propagación de la onda (es decir, hacia la dirección ventral), que compartía similitudes con la observada durante la administración mejorada por convección asistida por ultrasonido (UCED) de Tinte azul de Evans en el cerebro de roedores52. Suponemos que la disposición anisotrópica del espacio perivascular, por ejemplo, la interfaz entre la corteza y el cuerpo calloso ventral al sitio de la inyección, podría haber reducido la direccionalidad del transporte de solutos. La presencia de reverberación intracraneal, como se muestra en nuestra simulación numérica (Fig. 4c) también podría contribuir a una direccionalidad reducida del transporte a lo largo de la ruta de sonicación. Se necesitan más investigaciones para descubrir las rutas exactas y la dirección del aclaramiento linfático cerebral a través del volumen cerebral.

Observamos que la sonicación mejoró en gran medida el transporte del FITC-d inyectado intracorticalmente en el presente estudio. Este hallazgo contrasta con nuestra observación anterior según la cual el transporte de LCR FITC-d inyectado intracisternalmente no se vio afectado por FUS28. Nuestra hipótesis es que la diferencia se atribuyó a la diferencia de concentración local de los trazadores expuestos a la ruta de sonicación en la que la mayoría de los trazadores FITC-d inyectados intracorticalmente (por lo tanto sin diluir) fueron expuestos directamente al campo de presión acústica, impulsados ​​por el FUS a un mayor distancia que los trazadores inyectados intracisternalmente que se diluirían significativamente con el LCR.

Para permitir una eliminación detectable y el posterior drenaje de los trazadores intersticiales a los cLN, inyectamos una mayor cantidad de OA (20 µg) en la segunda serie del experimento y duplicamos el tiempo de sonicación (a 60 min). Como se anticipó, la OA se transportó más lejos en comparación con el primer experimento (Fig. 2B, D), con el mismo sesgo direccional rostral observado durante el primer segmento del estudio (Fig. 2E). A partir del examen de la OA drenada a los cLN en ausencia de sonicación (FUS-), el lado de la inyección de OA no tuvo ningún impacto en el aclaramiento de los cLN, como lo muestra la captación equivalente de OA de ambos cLN ipsilateral y contralateral al inyección. Sin embargo, la aplicación de FUS resultó en una captación de OA claramente mayor en los cLN, especialmente en el scLN ipsilateral a la sonicación (Fig. 3).

La mejora del drenaje de OA mediada por FUS también fue evidente en el dcLN ipsilateral, mientras que el porcentaje de área del trazador fue mucho menor que el de los scLN. Este drenaje preferencial de OA al scLN compartía similitud con un trabajo anterior que investigaba el movimiento del tinte azul de Evans observado después de la inyección intraestriado en ratones49. Sin embargo, este hallazgo fue diferente de otros estudios que han demostrado la ruta preferencial de eliminación de dcLN de los trazadores intersticiales y las células inmunes exógenas (células T) a través de una red de vasos linfáticos durales53,54. En cuanto a la causa de esta discrepancia, suponemos que la OA, distribuida con un sesgo espacial hacia la parte rostral del cerebro, se transportaba predominantemente a través del sistema linfático nasal y tenía mayor conectividad con el scLN que con el dcLN50. Una porción de la OA intersticial se transporta a la vasculatura de la superficie pial (visible en la figura 2C) y se recoge en los vasos linfáticos durales adyacentes, como las arterias meníngeas medias53,55, y luego se drena al dcLN, aunque en menor medida que los scLN. .

Además, encontramos grandes variaciones dentro del grupo en el drenaje de OA al cLN (Fig. 3), especialmente en el dcLN, donde no se detectó fluorescencia en algunos animales. El tiempo entre la inyección del trazador y la extracción de órganos se mantuvo en todos los animales y en el grupo; por lo tanto, el tiempo de recolección del trazador no habría jugado un papel importante en las variaciones observadas. Aunque no podemos determinar las causas de este hallazgo, suponemos que las variaciones individuales en la eficiencia del transporte de solutos cerebrales (por ejemplo, a través del transporte linfático y/o periarterial) pueden haberse ramificado en diferentes tiempos de tránsito de solutos hacia los clN. Un tiempo de espera más largo (de 1 h utilizado en el presente estudio) puede eventualmente permitir la recolección de trazadores en todos los animales. Como no podemos descartar completamente la contribución de otras rutas de eliminación de solutos (es decir, drenaje al seno venoso meníngeo a través de granulaciones aracnoideas o plexo coroideo), se necesitan más estudios para comprender las rutas de salida linfática detalladas, por ejemplo, a través de modelos animales grandes. ej., cerdo u oveja) que tienen granulaciones meníngeas aracnoideas más visibles. Los estudios en animales grandes también son atractivos, ya que las mayores dimensiones del cráneo reducirían significativamente la contribución de la reverberación acústica que se observó en el presente estudio.

Hasta donde sabemos, los presentes hallazgos representan la primera evidencia de que la aplicación pulsada de FUS puede mejorar regionalmente no solo el transporte, sino también la eliminación de solutos intersticiales del cerebro. El PM del OA utilizado en este trabajo fue comparable al de los oligómeros de Aβ neurorreactivos (~ 8–70 kDa)56, y el nivel mejorado de drenaje de OA sugiere un potencial terapéutico futuro prometedor de tFUS en la eliminación de Aβ. Se encontró que la frecuencia cardíaca, que puede afectar la pulsación de PVS (y el transporte de solutos asociado), así como otros signos vitales como la frecuencia respiratoria y la SpO2 que reflejan la profundidad de la anestesia, fue indiferente en todas las condiciones, lo que indica que nuestros resultados no se vieron confundidos por estas variables fisiológicas. Mediante simulación numérica de propagación acústica y análisis térmico (Fig. 4c, d), encontramos que la aplicación de FUS, debido a la baja intensidad utilizada, no calentaría el tejido cerebral. Aunque postulamos que la transmisión acústica conferida por FUS pulsado sirvió como la principal fuerza impulsora detrás del mejor transporte y eliminación de solutos intersticiales, el mecanismo subyacente sigue sin estar claro, ya que la presencia de dispersión acústica y interacciones acústicas complejas con el tejido cerebral poroelástico también pueden contribuir. al movimiento advectivo del soluto52. que posteriormente son recogidos por los vasos linfáticos meníngeos y los linfáticos nasales.

También observamos que un grado de alteración microscópica entre el PVS y el neuropilo presente durante la inyección directa del trazador puede hacer que una parte de los trazadores se filtre al PVS (y, en consecuencia, sea transportada por FUS). Aunque la técnica de inyección intracortical se adopta ampliamente en el estudio del movimiento de solutos intersticiales, el daño de las células gliales que puede acompañar a la inyección con aguja también puede reducir de forma aguda la función del canal AQP449, reduciendo el transporte del trazador. La experimentación con animales que no requieren inyección de trazadores exógenos, por ejemplo, en un modelo de EA en roedores y la posterior cuantificación del drenaje mediado por FUS de proteínas Aβ endógenas (alcanzable mediante tomografía por emisión de positrones), puede abordar la contribución de estos factores de confusión.

Los parámetros FUS utilizados en este trabajo, es decir, PD de 100 ms administrados en PRF de 1 Hz, no alteraron la actividad cerebral del EEG (Fig. 4a). Esto es consistente con la evidencia de una estimulación cerebral ineficiente asociada con el uso de un pulso acústico de larga duración57. Sin embargo, puede presentarse actividad neuronal a nivel celular inducida por la sonicación, lo que posteriormente puede afectar la eliminación de solutos cerebrales. Además, es posible que la propia sonicación haya alterado el nivel de expresión de AQP4 afectando el transporte de agua intersticial58. Por lo tanto, la evaluación de la función/expresión a nivel celular de AQP4 o la actividad neuronal (p. ej., c-Fos) afectada por FUS ofrecería más información sobre el mecanismo subyacente detrás de nuestra observación.

Reconocemos que la optimización de los parámetros de sonicación también está garantizada para maximizar el efecto de FUS con la menor intensidad acústica (y amplitudes de presión) posible. Por ejemplo, se puede adoptar una frecuencia más alta que la utilizada en este estudio (es decir, 200 kHz) para mejorar el transporte al mismo nivel de presión. Experimentos de infiltración de colorante in vitro en un medio poroso como la espuma hidrófila de alcohol polivinílico (PVA) (tamaño de poro promedio de 80 µm), que posee microestructuras porosas que imitan aproximadamente el PVS (PVS tubular de ~ 40 µm de diámetro a lo largo de cada lado de la pared arterial19) , se puede utilizar para optimizar los parámetros de sonicación antes de futuras aplicaciones in vivo. A este respecto, también se puede buscar el modelado numérico del comportamiento del trazador afectado por FUS para estimar el movimiento de soluto intersticial. Sin embargo, es importante señalar que el comportamiento de la transmisión acústica es altamente no lineal y depende de los parámetros de sonicación y la microestructura del medio poroso59. Por ejemplo, la transmisión de Eckart es dominante en estructuras que son mayores que la longitud de onda del ultrasonido, mientras que la transmisión de Rayleigh se vuelve dominante en estructuras más pequeñas que la longitud de onda60. Dado que aún se desconoce la citoarquitectura detallada del cerebro, incluido el PVS, la predicción numérica del movimiento fluídico realista (incluido el movimiento de los solutos) en el cerebro sería extremadamente desafiante, pero constituiría un tema para futuras investigaciones.

Con respecto a la técnica experimental, que implicó un tiempo de espera posterior a la inyección del trazador de 30 minutos antes de la aplicación de FUS, previamente informamos que la misma intensidad de FUS en el cerebro de rata, se aplicó un tiempo corto (p. ej., 7 minutos) después de la inyección intracortical. La inyección de trazadores intersticiales causó hemorragia intracraneal masiva en una porción significativa de los animales probados61. Sin embargo, no observamos ninguna hemorragia en el presente protocolo de experimento, lo que sugiere que el aumento del tiempo de espera de 30 minutos antes de la sonicación permitió que la estructura cerebrovascular deteriorada (causada por la inyección con aguja) se cerrara, evitando la hemorragia.

Observamos varias limitaciones técnicas de nuestro enfoque. Se sabe que el método de fijación (es decir, perfusión de PFA), a pesar de considerarse el estándar de oro en la fijación de tejidos, reduce el volumen de PVS19 y, por lo tanto, puede disminuir el nivel de fluorescencia observado en el tejido cerebral. A pesar de esta limitación, la perfusión de PFA utilizada de manera uniforme en todos los grupos experimentales no alteraría los efectos observados de FUS para mejorar el transporte y la eliminación de solutos cerebrales. Como alternativa se puede considerar la fijación por inmersión; sin embargo, el largo tiempo de fijación necesario para el cerebro de rata relativamente grande (en comparación con el cerebro de ratón)62 puede generar artefactos aún más indeseables, mientras que el impacto de la fijación por inmersión en el sistema linfático del cerebro no se comprende completamente. Por lo tanto, es muy deseable la adopción de técnicas de imagen como la microscopía de dos fotones in vivo durante la sonicación para monitorear el movimiento/distribución del trazador intersticial en animales vivos19. También reconocemos que el estudio actual se realizó solo en ratas macho, lo que requiere experimentación en ratas hembra para examinar cualquier diferencia específica de género en los efectos de FUS, ya que recientemente se encontró en humanos una arquitectura de los vasos linfáticos meníngeos dependiente del género63.

El transporte intersticial de solutos eficiente y la eliminación linfática de los desechos metabólicos indeseables del cerebro son vitales para la función cerebral normal. Demostramos que la aplicación transcraneal de FUS promovió de forma no invasiva el movimiento y el drenaje de solutos inyectados intracorticalmente en ratas. En los seres humanos, el área del cerebro que requiere eliminación de desechos no se limitaría a un solo lugar; por ejemplo, áreas relativamente grandes en las regiones neocorticales muestran una mayor carga de Aβ durante la etapa preclínica de AD64. Por lo tanto, en consideración de su posible aplicación en humanos, un sistema FUS y un diseño de transductor deberían apartarse de un medio tradicional de entrega focal única de ondas acústicas y, en su lugar, permitir la sonicación de formas amplias e irregulares del volumen de interés del cerebro. La dirección electrónica del haz/enfoque FUS se puede lograr utilizando la configuración del transductor de matriz en fase65, pero también se puede concebir como alternativa una dirección mecánica más simple del ultrasonido. Además, también se pueden utilizar lentes acústicas impresas en 3D acopladas a un material piezoeléctrico para sonicar en la forma deseada cubriendo un volumen mucho más amplio66. Como la eliminación de desechos cerebrales puede requerir múltiples sesiones de FUS, la ergonomía del diseño del transductor para la comodidad del paciente se convertirá en un factor importante. En resumen, aunque comprender los mecanismos detallados de eliminación de desechos del cerebro exige una intensa investigación futura, FUS, al tener la capacidad de facilitar regionalmente el movimiento del LCR/soluto intersticial, posee el potencial no invasivo muy necesario para mejorar de forma controlada el transporte de desechos, incluida la eliminación. del cerebro.

Se utilizaron Texas Red OA de 45 kDa MW (Thermo Fisher) y FITC-d de 2000 kDa MW (Millipore Sigma) como trazadores fluorescentes intersticiales. Dado que el OA tiende a agregarse en una solución de FITC-d, los trazadores se prepararon por separado, cada uno de los cuales se constituyó a una concentración del 0,5% en peso en LCR artificial (aCSF; Tocris Bioscience). En el segundo experimento que evaluó el grado de eliminación de solutos cerebrales a los cLN, solo se utilizó OA porque la eliminación de FITC-d de gran MW a los cLN es mínima durante un período experimental de ~ 2 h. Para aumentar la sensibilidad de detección de OA drenada a los cLN, se preparó OA a una concentración aumentada (1% en peso) en LCRa.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Brigham and Women's Hospital y se llevaron a cabo en pleno cumplimiento de sus regulaciones y estándares. Todos los métodos se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Se alojaron socialmente ratas Sprague-Dawley (SD) (todas machos, n = 46) (dos ratas/jaula) bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h (luces encendidas a las 7 a. m., apagadas a las 7 p. m.) y se les permitió Acceso a alimentos y agua ad libitum. Las ratas se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina. Después de alcanzar la profundidad anestésica adecuada, se afeitó la cabeza del animal utilizando una maquinilla y loción depilatoria. Luego se colocó al animal sobre un marco estereotáctico (ASI Instruments) mientras se colocaba una almohadilla térmica a 37 °C (Gaymar) debajo del animal para mantener su temperatura corporal. El plano anestésico se evaluó cada 10 minutos comprobando el reflejo de pellizco del dedo del pie. Se administraron dosis anestésicas adicionales (1/3 a 1/2 dosis cada una) según fuera necesario. Las frecuencias respiratoria y cardíaca, junto con la oxigenación de la sangre periférica (SpO2) medida con un oxímetro de pulso (Smiths Medical), se registraron justo antes de la aplicación de FUS (o el inicio de la condición de control) y cada 15 minutos hasta el final de la sonicación. .

La solución trazadora preparada se inyectó intracorticalmente según los protocolos quirúrgicos establecidos4,7. Después de la administración preventiva de clorhidrato de lidocaína al 2% debajo de la piel cerca de la incisión, se realizó una incisión en la línea media para exponer el cráneo e identificar el bregma. Se perforó un orificio en el cráneo (Fine Science Tools) 3 mm lateral y 1 mm caudal al bregma sin perforar la duramadre. Luego, se insertó estereotácticamente una aguja de calibre 30 (30G) (0,1 ml, Hamilton) a 2 mm de profundidad a una velocidad de 2 mm/min. La dirección del bisel de la aguja apuntaba hacia la dirección rostral en todas las condiciones experimentales. Los trazadores se inyectaron a una velocidad de 0,25 µl/min durante 2 minutos (un volumen total de 0,5 µl) utilizando una bomba de jeringa (KD Scientific). Después de un período de espera de 5 minutos, la aguja se retrajo a 0,5 mm/min durante 4 minutos. En el experimento que examinó el efecto de FUS en el drenaje de OA a los cLN, se inyectaron 2,0 µL de solución trazadora a una velocidad de 0,25 µL/min durante 8 minutos, donde se aleatorizó el lado de la inyección (hemisferio izquierdo o derecho). y equilibrado entre los animales.

Un transductor FUS (Ultran Group), que funciona a una frecuencia fundamental de 200 kHz, fue accionado por una forma de onda eléctrica sinusoidal procedente de un generador de funciones (Keysight) conectado a un amplificador de potencia lineal de 40 vatios (Electronics and Innovations). El perfil espacial de la amplitud de la presión se mapeó directamente con una resolución de paso de 1 mm utilizando un hidrófono de aguja (Onda Corp) montado en una etapa robótica de 3 ejes en un tanque de agua desgasificada según un método descrito en detalle en otro lugar33. La presión en el foco acústico se calibró con respecto al voltaje de entrada utilizando un hidrófono calibrado (Onda Corp).

El animal se colocó sobre una plataforma de sonicación robótica estereotáctica construida internamente (Newmark Systems) equipada con barras para orejas y mordidas. El movimiento plano del transductor FUS, que estaba unido a una plataforma de traslación horizontal, se controló de forma independiente con respecto a la plataforma de movimiento vertical sobre la que se colocó el animal. Todas las etapas motorizadas tenían una precisión espacial de 15 µm. Antes de la sonicación, el sitio de inyección intracortical se marcó con un bolígrafo quirúrgico para alinear la ruta acústica con el sitio de inyección, y se mantuvo un espacio de ~ 8 mm entre el cuero cabelludo y el plano de salida del transductor para colocar el foco acústico en el lugar de inyección (2 mm ventral desde el cuero cabelludo). El espacio entre el transductor y el cuero cabelludo se rellenó con un gel de acoplamiento acústico comprimible que se preparó con una solución acuosa de alcohol polivinílico al 9% p/v (Millipore Sigma), que se moldeó mediante dos ciclos de congelación y descongelación de 16 h a 8 h. Se aplicó hidrogel acústico (Parker Lab) a todas las interfaces.

Anteriormente se había descubierto que la FUS, administrada inmediatamente después de la retracción de la aguja, causa hemorragia intracraneal61. Por tanto, se introdujo un período de espera de 30 minutos después de la retracción de la aguja. También se ha demostrado que el tiempo de espera previene el flujo retrógrado del trazador67. Luego, se administró FUS estereotácticamente en el lugar de la inyección de forma pulsada durante 30 minutos (n = 7 en cada grupo). Los otros siete animales (en cada grupo de trazador) no recibieron ninguna sonicación, lo que constituye una condición de control (es decir, condición 'FUS-'). En el experimento que examinó el efecto de FUS sobre la eliminación de OA inyectada intracorticalmente, se administraron los mismos parámetros de sonicación (n = 8) durante 60 minutos para acomodar el tiempo necesario para el drenaje detectable del trazador intracortical a los cLN. Ocho ratas se sometieron al mismo procedimiento sin recibir sonicación (condición 'FUS-').

Inmediatamente después de una sesión de FUS (incluida la condición sin sonicación en los grupos de control), se realizó una necropsia para recolectar el cerebro del animal mediante perfusión transcardial de paraformaldehído (PFA) al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (Boston Bioproducts). El tiempo entre la inyección del trazador y la finalización de la perfusión transcardial (~ 30 min) se mantuvo en todos los animales. El tejido extraído se sometió a una fijación sumergida adicional de 24 h en PFA. En el segundo experimento que examinó los efectos de FUS en el drenaje de OA, se eliminaron tanto el dcLN como el scLN. El cerebro se cortó en un bloque de 6 mm de ancho que abarcaba el foco acústico y luego se seccionó en rodajas de 200 µm de espesor utilizando un vibratomo (Ted Pella) a lo largo de la dirección rostral-caudal. Se tomaron imágenes de los cortes seccionados, la superficie dorsal del cerebro y los ganglios linfáticos con un microscopio fluorescente de campo amplio (Nikon) utilizando un sensor CMOS de campo ultraancho (23,4 mm × 15,6 mm) (resolución de 4592 px × 3056 px, Sony). En el segundo conjunto de experimentos, también se tomaron imágenes de la superficie lateral del cerebro de algunas ratas (n = 5:5, FUS +: FUS-) para visualizar el patrón de distribución del trazador de OA sobre la vasculatura de la superficie pial lateral. Todas las imágenes se separaron mediante canales de color en imágenes de 8 bits y las imágenes resultantes en escala de grises con emisión fluorescente adecuada se utilizaron para el análisis posterior.

Para estimar el volumen del trazador (tanto OA como FITC-d) de cada sección del vibratomo, la ubicación de las imágenes seccionadas obtenidas de cada animal se alineó con respecto al sitio de inyección (indicado como 0 mm) y se estableció un umbral por encima de tres veces la desviación absoluta media. de distribuciones de intensidad para delinear los píxeles que muestran la captación del trazador. Luego, el volumen de absorción del trazador en cada sección se derivó del número de píxeles delineados (píxel de la imagen = 4,33 pL). El área de distribución de OA en las imágenes de la superficie dorsal del cerebro se segmentó utilizando el valor medio de los niveles de umbral automáticos (el algoritmo de isodatos implementado en ImageJ68) aplicado a las imágenes del grupo FUS +. Para calcular el porcentaje de área de absorción de OA por los cLN, ambos cLN extraídos se colocaron bajo el mismo campo de visión del microscopio para obtener imágenes. Para tener en cuenta la fluorescencia más baja que las imágenes de la superficie del cerebro, el área de captación de OA en los cLN se segmentó utilizando un 50% por encima del valor de umbral automático desde la imagen ipsilateral a la inyección de OA. El área ocupada por los cLN se segmentó a partir de la imagen de campo brillante (21,6 µm2/píxel).

Para minimizar el artefacto eléctrico asociado con el contacto proximal con el transductor (es decir, el transductor puede haber actuado como un condensador durante la sonicación pulsada y generado un artefacto de pico), la sonicación se administró al cerebro ventralmente a través del cuello utilizando nuestra técnica anterior28. Se insertaron dos electrodos EEG de alambre subdérmico (Ives EEG Solutions) debajo de la piel de la línea media sobre el cuero cabelludo con un espacio de ~ 10 mm, y se conectó un electrodo de tierra a una oreja. El EEG se midió cada segundo, 300 veces, de forma sincronizada (de -100 a 700 ms con respecto al inicio de la sonicación) y posteriormente se promedió después de aplicar un filtro de paso bajo y de red de 100 Hz. El EEG también se adquirió del mismo animal sin sonicación, con la secuencia de control y condiciones de sonicación aleatorias entre los animales.

Se colocaron 150 µl de cada solución trazadora en el foco acústico (sobre una película delgada de tereftalato de polietileno para una transmisión acústica ininterrumpida; espesor nominal de 13 µm, la absorción de energía acústica fue indetectable mediante medición con hidrófonos) y se sonicaron usando parámetros idénticos a los dados al animales. Se preparó el mismo volumen de trazador sin sonicación para proporcionar una condición de control. Inmediatamente después de la sonicación, se cargaron 10 µl de trazadores sonicados y no sonicados (n = 8 cada uno) en un gel de agar (agarosa con baja temperatura de gelificación, 0,8 % en peso, Sigma) en una solución tampón (1:1 en volumen = normal solución salina: agua destilada) y se sometieron a electroforesis en gel durante 25 min (voltaje constante de 48 V, Minipcr). Luego se fotografió la elución.

La información sobre la geometría tridimensional de los cráneos se obtuvo a partir de cráneos de ratas ex vivo (n = 3; sin los huesos mandibulares) mediante tomografía computarizada (CT, Fuente 60 kV, Bruker) para la simulación numérica de la propagación acústica dentro del cráneo. Las imágenes de TC se adquirieron en vóxeles isotrópicos de 17 µm y se volvieron a muestrear a iso-vóxeles de 0,25 µm, produciendo una relación de 30 píxeles por longitud de onda en agua (λ = ~ 7,5 mm a 200 kHz) para lograr una discretización espacial suficiente para la simulación35. La fuente FUS se modeló según nuestro método anterior69 de acuerdo con la geometría del transductor (diámetro del transductor de 28 mm y radio de curvatura de 22 mm) y se colocó de acuerdo con la geometría de sonicación utilizada en el experimento con animales. La ecuación linealizada de Westervelt-Lighthill para analizar la propagación de ondas acústicas se resolvió mediante el esquema numérico del dominio de tiempo de diferencias finitas (FDTD) en un volumen que abarca tanto el transductor como el cráneo (183 × 275 × 266 vóxeles), con una resolución temporal de 0,05 µs. . Los vóxeles en la imagen se expresaron en valores de unidades Hounsfield (HU) que están calibrados en un tubo de agua ubicado dentro del mismo volumen de la imagen, y las propiedades acústicas del cráneo (es decir, velocidad del sonido, densidad y atenuación) se utilizaron en la imagen. simulación, como se describe en nuestro trabajo anterior69. A partir de la distribución espacial resultante de la intensidad acústica, se resolvió posteriormente la ecuación de transferencia de biocalor mediante el método FDTD70. El cambio de temperatura en serie temporal en los medios se obtuvo con una resolución temporal de 10 ms, y los parámetros de sonicación (ISPPA de 5 W/cm2, PD de 100 ms, PRF de 1 Hz [es decir, ciclo de trabajo del 10 %] y un duración máxima de sonicación de 1 h) se utilizaron en la estimación asumiendo tejido cerebral intracraneal homogéneo a una temperatura inicial de 37,5 °C. Propiedades térmicas del cerebro (capacidad calorífica específica c de 3600 J/kg/K, conductividad térmica κ de 0,528 W/K/m), cráneo (c de 1300 J/kg/K, κ de 0,4 W/K/m) y la perfusión sanguínea (c de 3620 J/kg/K, tasa de perfusión de 8,24 kg/m3/s y densidad de 1030 kg/m3) se utilizaron como entradas en la simulación71. Todas las simulaciones se realizaron en un entorno de unidad de procesamiento gráfico (GPU) con procesamiento paralelo. Para sobreestimar de manera conservadora el posible aumento de temperatura en el tejido cerebral de rata, no se modelaron las contribuciones de las respuestas termorreguladoras y la pulsación del LCR que transfieren/eliminan la deposición de calor72.

Se realizó un análisis estadístico utilizando el software MATLAB (Statistics and Machine Learning Toolbox, Mathworks). La normalidad y esfericidad de la distribución de los datos se examinaron mediante la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Mauchly, respectivamente. Se realizó la prueba Kruskal-Wallis H para examinar las diferencias en el peso de los animales entre los grupos. Se realizó un análisis de variables de medidas repetidas (ANOVA) para examinar la presencia de cambios dependientes del tiempo en los signos vitales (frecuencia cardíaca/respiratoria y SPO2) entre los grupos, por separado para el tipo de trazadores. Las diferencias específicas de la condición en la distribución de volumen/superficie y el porcentaje de área de OA en los ganglios linfáticos se evaluaron mediante la prueba de Mann Whitney y la prueba de rango con signo de Wilcoxon (comparaciones hemisféricas dentro de un grupo). Los datos de EEG de series temporales y la distancia de elución del trazador de la electroforesis se evaluaron mediante una prueba t. La significación estadística se estableció en P <0,05.

Sin realizar cirugía para la inyección del trazador, se colocaron dos ratas en el marco estereotáctico y se administró sonicación durante 1 h en la misma coordenada que el sitio de inyección en referencia a la línea interaural. El pelaje sobre la cabeza se afeitó antes de la FUS. Una semana después, las ratas fueron sacrificadas mediante desangrado y posterior perfusión transcardial (4% formaldehído). El área del cerebro sonicada se seccionó coronalmente y se tiñó con H&E (GHS-2–16, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para detectar necrosis o hemorragia, caspasa-3 IHC (ab4051, Abcam, Cambridge, Reino Unido) para visualizar la apoptosis. células, VAF-azul de toluidina (A3908, Sigma-Aldrich) para detectar la presencia de daño isquémico y GFAP (ab7260, Abcam) para detectar infiltración de glía que puede estar asociada con neuroinflamación. La hibridación cromogénica in situ para IHC se realizó utilizando un kit de detección de refinamiento de polímeros de enlace (DS9800, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) con recuperación de antígeno de citrato basada en un factor de dilución de anticuerpo primario de 1:300 para GFAP y 1:500 para caspasa- 3.

Todos los datos se incluyen y presentan a través de Información complementaria. Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están seleccionados y están disponibles públicamente en el repositorio de datos de Harvard Dataverse. https://dataverse.harvard.edu/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.7910/DVN/GM0OI6

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Agradecemos al Dr. Yongzhi Zhang por la preparación inicial de las técnicas quirúrgicas.

Departamento de Radiología, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 75 Francis Street, MA, 02115, Boston, EE. UU.

Seung-Schik Yoo, Evgenii Kim, Kavin Kowsari, Jared Van Reet y Hyun-Chul Kim

Departamento de Inteligencia Artificial, Universidad Nacional Kyungpook, Daegu, República de Corea

Hyun Chul Kim

Escuela de Ingeniería y Ciencias Computacionales, Universidad de Yonsei, Seúl, República de Corea

Kyungho Yoon

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SSY, EK y HCK participaron en el diseño del estudio, la preparación de equipos, la adquisición y análisis de datos. KK y JVR participaron en la adquisición de datos. KY participó en el análisis de datos. Todos participaron en la redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Seung-Schik Yoo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Yoo, SS., Kim, E., Kowsari, K. et al. Mejora no invasiva del aclaramiento de solutos intracorticales mediante ultrasonido focalizado transcraneal. Informe científico 13, 12339 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39640-2

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Recibido: 23 de abril de 2023

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39640-2

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